Защита диссертации Иқсат Нұргүл Нұрқанатқызы на соискание степени доктора философии (PhD) по образовательной программе «8D05107 - Биология»
В Евразийском национальном университете имени Л.Н. Гумилева состоится защита диссертации на соискание степени доктора философии (PhD) Иқсат Нұргүл Нұрқанатқызы на тему «Модуляция селективного распознованияи гидролиза РНК вируса для стимулирования антивирусной устойчивости растений к патогену» по образовательной программе «8D05107 – Биология».
Диссертация выполнена на базе Евразийского национального университета им. Л.Н. Гумилева в научной лаборатории биотехнологии растений имени Рустема Омарова (г. Астана, Казахстан) и Киевского национального университета имени Тараса Шевченко (г. Киев, Украина).
Язык защиты - казахский
Официальные рецензенты:
Бисенбаев Амангельды Куанбаевич – Академик Национальной академии наук Республики Казахстан, доктор биологических наук, профессор кафедры молекулярной биологии и генетики Казахского национального университета имени аль-Фараби (г.Алматы, Республика Казахстан).
Сапахова Загипа Бейсеновна – доктор философии (PhD), ассоциированный профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории селекции и биотехнологии, Института биологии и биотехнологии растений (г. Алматы, Республика Казахстан).
Временные члены Диссертационного совета:
Жамбакин Кабыл Жапарович – Академик Национальной академии наук Республики Казахстан, профессор, доктор биологических наук, генеральный директор Института биологии и биотехнологии растений (г. Алматы, Республика Казахстан).
Солтабаева Айгерим Даулетбеккызы - доктор философии (PhD), ассоциированный профессор, инструктор по биологии, Школа естественных социальных и гуманитарных наук, Назарбаев Университет (г. Астана, Республика Казахстан).
Джатаев Сатывалды Адинеевич – кандидат биологических наук, ассоциированный профессор кафедры земледелия и растениеводства Казахского агротехнического университета имени С.Сейфуллина (г. Астана, Республика Казахстан).
Бектурова Айзат Жамбуловна - доктор философии (PhD), постдокторант университета Бар-Илан, Израиль.
Научные консультанты:
Масалимов Жаксылык Каирбекович – доктор философии (PhD), кандидат биологических наук, ассоциированный профессор, заведующий кафедры биотехнологии и микробиологии Евразийского национального университета им. Л.Н. Гумилева (г. Астана, Республика Казахстан).
Алекс Шевченко – доктор философии (PhD), ассоциированный профессор Киевского национального университета имени Тараса Шевченко (г. Киев, Украина).
Защита состоится: 29 апреля 2024 года 12:00 часов в Диссертационном совете по направлению подготовки кадров «8D051 – Биологические и смежные науки» по специальности «8D05107 – Биология» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева. Проведение заседания диссертационного совета в онлайн формате.
Ссылка: https://us06web.zoom.us/j/86278516508?pwd=Jk0PZm4ahGLzEBWI1bPaPy6plvIfbQ.1
Идентификатор конференции: 862 7851 6508 Код доступа: 609988
Адрес: г. Астана, ул. Кажымукана, 13 үй, корпус №3, аудитория №333.
Аннотация (рус.): Общее описание исследования. В диссертации описаны исследования с использованием системы CRISPR/Cas13 для придания устойчивости растений к вирусу кустистостой карликовости томатов (TBSV). Кроме того, в этом исследовании описаны возможности повышения эффективности системы CRISPR/Cas13 путем совместной трансформации растений белком-супрессором РНК-интерференции P19 и термообработки для создания эффективных стратегий защиты от вирусных патогенов. В работе использовались методы молекулярной биологии и генной инженерии. Актуальность темы исследования. Во всем мире вирусы растений снижают качество и количество урожая, наносят значительный ущерб производству сельскохозяйственных культур. В Казахстане вирусы повреждают экономически важные культуры и наносят значительный экономический ущерб. В связи с этим разработка новых методов повышения устойчивости растений к вирусным возбудителям играет важную роль в области биологии растений. Технология CRISPR открывает новые возможности в повышении продуктивности растений и устойчивости к биотическим и абиотическим стрессовым факторам окружающей среды. В частности, использование CRISPR в сочетании с вирусными последовательностями в качестве направляющих молекул позволяет получать устойчивые к вирусам линии растений. Согласно недавним исследованиям, систему CRISPR/Cas9 можно эффективно использовать для индукции иммунитета у растений путем избирательного воздействия на нуклеиновые кислоты вирусов. Кроме того, этот подход позволяет специфично воздействовать на гены, связанные с восприимчивостью хозяина, особенно в случае РНК-вирусов. Различные системы доставки конструкций CRISPR с направляющей РНК, включая метод транзиентной экспрессии генов CRISPR, способны активировать защитные механизмы против трансгенов в растительных клетках. Опубликованы работы о возможности использования CRISPR/Cas13a при разработке антивирусных технологий на основе РНК. Основными вопросами по оптимизации любой CRISPR/Cas системы являются выбор методов доставки в эукариотические системы, использование оптимального промотора для повышения экспрессии мРНК нуклеаз семейства Cas и гидовых РНК. Одним из факторов низкой экспрессии CRISPR/Cas системы в растениях является активность РНК-интерференции, направленной на деградацию экзогенных мРНК. В связи с этим широко используется метод ко-экспрессии целевого гена с супрессором РНКи – Р19. Кроме того, недавние исследования показали, что эффективность системы редактирования CRISPR/Cas9 можно повысить в растениях Arabidopsis за счет совместной экспрессии белка P19. Следовательно, изучение функциональных взаимодействий между механизмом РНК-сайленсинга и системы редактирования генов имеет большое значение. Помимо различия в структуре генома, еще одной переменной между различными биологическими системами, которая может влиять на активность CRISPR/Cas, является температура. Температура влияет на многие биологические параметры и некоторые из них (кинетика ферментативной реакции, структура хроматина, пути репарации ДНК) могут напрямую влиять на способность CRISPR/Cas вызывать мутации в геномах эукариот или работать на уровне транскриптов, деградируя РНК-вирусы. Следовательно, возможно, что температура может способствовать наблюдаемой вариации эффективности всех CRISPR/Cas в организмах. Технология CRISPR/Cas успешно применялась на модельных растениях, таких как Arabidopsis и Nicotiana, а также на таких важных культурах, как пшеница, кукуруза и рис. Информация о нацеливании на некодирующие гены скудна. До сих пор технология CRISPR/Cas применялась исключительно в клеточных линиях человека, мышей или рыбок данио для нокаута генов микроРНК или днРНК. В настоящее время в растениях Информации о технологии CRISPR/Cas13, нацеленной на пре-микроРНК и микроРНК, нет. Анализ функциональных характеристик и механизма действия микроРНК , вызывающих важные реакции на стресс, облегчит в будущем выбор устойчивых сортов. В качестве одного из модельных растений роль и молекулярный механизм микроРНК в ответ на стресс у табака , особенно микроРНК и днРНК, помогут разгадать функцию связанных со стрессом нкРНК у других видов. Устойчивость одного гена постепенно стала неудовлетворительной для растениеводства в некоторых районах, и срочно необходимы стратегии по выведению устойчивых культур в новых направлениях. Таким образом, эволюция микроРНК и ее направления являются важной составляющей эволюции растений. Адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды, например воздействию новых или модифицированных типов вирусов, можно достичь путем выбора видов растений, экспрессирующих модифицированный арсенал микроРНК. Цель исследования: изучение регуляции и оценки эффективности системы CRISPR/Cas13 в механизмах взаимодействия РНК-вирусов и растений. Цели исследования: 1. Создание конструкции pk2GW7-pCas13a, обеспечивающей экспрессию в растительных клетках; 2. Изучение in planta сайленсинга вируса кустистой карливости томатов (TBSV) при использовании системы CRISPR/Cas13; 3. Сравнение различных последовательностей crРНК-GFP и crРНК-P19 на эффективность нацеливания на вирусную РНК системы CRISPR/Cas13; 4. Изучение влияния вирусной инфекции на микроРНК растений; 5. Изучение влияния котрансформации супрессора РНК-интерференции - белка Р19 с целью повышения эффективности векторов; 6. Определение эффективности температурного воздействия на экспрессию системы CRISPR/Cas13. Объект исследования. Nicotiana benthamina, Tomato Bushy Stunt Virus, CRISPR/Cas13. Методы исследования: дизайн и конструирование ортологов Cas13 для экспрессии в растениях, конструирование экспрессирующих конструкций crРНК-GFP и crРНК-P19, рекомбинационное клонирование LR Gateway, транзиентная экспрессия, in vitro транскрипция, инокуляция вирусным материалом , экспресс анализ очистки вирусных частиц, SDS-PAGE, вестерн-блоттинг, экспресс анализ обнаружения вирусных частиц , иммунопреципитация , выделение микроРНК , NATIVE PAGE, ИФА для 8-оксогуанина, жидко-жидкостное разделение фаз, qRT-PCR, электрофорез в горизонтальном агарозном геле . Научная инновация исследований. Предлагаемая тема исследования в настоящее время в Казахстане не изучается. Влияние различных термических обработок на уровни экспрессии Cas13 при CRISPR-опосредованной деградации вирусной РНК у растений мало исследовано. Кроме того, в этой работе впервые изучена роль экспрессии белка-супрессора P19 как средства повышения эффективности системы редактирования генов для получения устойчивых к патогенам трансгенных растений. Влияние различных уровней экспрессии Р19 на CRISPR-опосредованное редактирование микроРНК у растений мало изучено. В совокупности результаты обеспечивают платформу для сосредоточения внимания на наиболее насущные проблемы, связанные с быстрой эволюцией вирусов и уклонением от CRISPR/ Cas системы вирусов. Теоретическая и практическая значимость исследования. Научно-технический эффект результатов проекта заключается в получении новых фундаментальных данных о взаимодействии вируса и растения с использованием технологии редактирования генов. Полученные научные результаты могут быть использованы в учебном процессе в области биологии и биотехнологии. Эти исследования могут стать основой для прикладных исследований и разработок по созданию устойчивых к вирусам растений. Экономическая эффективность результатов данной работы заключается в технологии, позволяющей получать сельскохозяйственные организмы с заданными характеристиками, что способствует повышению продуктивности и снижению себестоимости продукции. Основываясь на результатах этой исследовательской работы, ключевые виды растений, важные для продовольственной безопасности, могут быть созданы для использования механизмов CRISPR/pCas13 против одного или нескольких вирусов и, возможно, других патогенов. Результаты данной диссертационной работы стали основой для грантового финансирования на 2023-2025 гг. по проекту «Жас ғалым» AP19174389 «Модуляция CRISPR/Cas13 системы редактирования генов для стимулирования антивирусной устойчивости растений» при поддержке МНиВО РК, а также для на программно-целевого финансирования научных, научно-технических программ BR21882269 « «Использование технологии редактирования генома для повышения продуктивности экономически важных культурных растений» задание 3 «Разработка системы редактирования генов CRISPR/Cas13 для обеспечения противовирусной устойчивости растений» КН РК на 2023-2025 гг. Основные положения, выдвигаемые на защиту диссертации: 1. Был проведен in silico дизайн по сборке Cas13 и crРНК, направленных против вируса дикого типа TBSV и его мутантов для дальнейшей экспрессии в растениях N. Benthamiana. Созданная конструкция pK2GW7-pCas13a была транзиентно экспрессирована в растения. Была рассмотрена перспектива универсального использования системы CRISPR/Cas13 в борьбе со всеми вирусами, принадлежащими к роду Tombusvirus при создании crРНК, специфично нацеленных на белок P19 вируса TBSV. 2. Была изучена молекулярная интерференция против TBSV, используя экспрессию Р19 белка как показатель титра вирусных частиц в присутствии системы CRISPR/Cas13. Было показано успешное вмешательство системы CRISPR/Cas13, направленной против супрессорного белка Р19. 3. Была сравнена эффективность нацеливания системы CRISPR/Cas13 на вирусную РНК между различными последовательностями crРНК-GFP и crРНК-P19. Все crРНК показали снижение уровней экспрессии GFP в инокулированных листьях под ультрафиолетовым светом по сравнению с контролями. Кроме того, более низкие, но поддающиеся обнаружению уровни снижения сигнала GFP были обнаружены в crРНК- GFP, тогда как более высокие уровни снижения наблюдались с crРНК, направленных на Р19. Потенциальная возможность лучшей направленной активности crРНК, комплементарной последовательности P19 генома TBSV, по сравнению с другим таргетом связана с функцией P19 в вирусном геноме в качестве супрессора защитного механизма РНК-интерференции хозяина. Любое дозо-зависимое изменение уровня P19 может повлиять на распространение вируса в растительной клетке, как это было показано на мутантах TBSV и образования комплексов киРНК-Р19. С другой стороны, более высокие сигналы GFP наблюдались в контроле с неспецифической nsgcrРНК и в растениях N. benthamiana, инокулированных диким типом, что подтверждает эффективность системы CRISPR/рCas13a для вирусной интерференции. 4. Исследовано взаимодействие белка-супрессора P19 с функцией miR растений в биологическом контексте. Были разработаны специфические праймеры на микроРНК и их предшественников. Была сравнена относительная экспрессия растительных микроРНКв присутствии и отсутствии системы CRISPR. Было обнаружено, что дифференциальный эффект белка P19 на экспрессию miR 168 и 162 был наибольшим на ранней стадии вирусной инфекции. Результаты показали, что влияние P19 на функции miR растений заключалось не в развитии симптомов, а в противовирусных реакциях растений. Экспрессия двух из этих микроРНК также была обнаружена в присутствии системы CRISPR/Cas13a, направленной против TBSV дикого типа. 5. С целью повышения эффективности векторов изучено влияние направленной ко-трансформации супрессора РНК-интерференции - белка Р19 на накопление целевого гена. Была получена повышенная экспрессия рекомбинантного белка в растительных тканях в образцах, ко-трансформированных с Р19 белком. На основе полученных данных создана рабочая модель функционального взаимодействия растительной РНК-интерференции и системы CRISPR/Cas13. Исследована роль белка Р19 как модулятора регуляции системы CRISPR/Cas13 у растений. 6. Разработана новая методика повышения эффективности системы CRISPR/Cas с использованием модуляции температуры. На основании полученных результатов было определено, что 370С является наиболее оптимальной температурой для получения повышенной экспрессии белка pCas13a. Личный вклад автора. Обзор литературы, связанной с научным исследованием, определение целей и задач диссертации, проведение практической работы, обсуждение результатов исследования, проведение статистического анализа, написание докторской диссертации, подготовка работы согласно нормативным требованииям и внедрение полученных результатов исследования в учебный процесс студентам специальности «Биотехнология растений» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева осуществлялось при личном участии автора. В ходе диссертационной работы были соблюдены высокие стандарты интеллектуальной честности и предотвращения подделки научных данных, фальсификации, плагиата и ложного соавторства. Связь работы с исследовательскими программами. Диссертационная работа была выполнена в рамках грантвого финансирования 2021-2023 гг. AR09258746 «Регуляция CRISPR/Cas13 системы редактирования генов при помощи вирусного белка для придания растениям антивирусной устойчивости» МНВО РК в Евразийском национальном университете имени Л.Н.Гумилева в научной лаборатории биотехнологии растений имени Рустема Омарова (Казахстан, Астана) и кафедры вирусологии Национального университета имени Тараса Шевченко, НИИ «Биология и медицина» (Украина, Киев). Кроме того, методы, использованные в диссертации, были оптимизированы во время стжировок в Университете Бен-Гурион (Израиль, Негев) и Силезском университете (Польша, Катовице). Апробация результатов исследования. Результаты исследования и основные положения диссертации были доложены и представлены на международных и республиканских конференциях: - «Bioresources and Viruses» X Международная конференция, 2023, Киев, Украина; - «Актуальные проблемы микробиологии, биотехнологии и биоразнообразия» международный научно - практическая конференция, 2022, Астана, Казахстан ; - XVII Международная научная конференция студентов и юношества «ǴYLYM JÁNE BILIM - 2022» 2022, Астана, Казахстан ; - IV международной научной конференции «Биологическое разнообразие азиатских степей» - 2022, Астана, Қазақстан; - Международный научный форум молодых ученых «БИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ ВЕКА XXI -2021» 2022, Астана, Қазақстан; - «TENDENZE ATTUALI DELLA MODERNA RICERCA SCIENTIFICA», международная научно-практическая конференция, 2020, Штутгарт, Германия; - II Международный научно-практическая конференция, 2020, Екатеринбург, Россия федерация . Статьи. Результаты диссертации представлены в 19 опубликованных статьях, в том числе 1 статья (49%) и 1 тезис (Q2) в журналах с импакт-фактором выше нуля, рекомендованных а базах данных Web of Science и Scopus, 4 статьи в журналах, рекомендованных КОКНВО МНиВО РК, 12 тезисов и статей на международных научных конференциях, а также 1 патент на полезную модель. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 96 страницах и состоит из определений и сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, списка из 120 использованных источников, 9 таблиц и 59 рисунков. Благодарности. Данная работа посвящается уважаемому наставнику, профессору Рустему Омарову, который внес большой вклад в наши знания, развитие науки и являлся примером для подражания.
Отзыв зарубежного консультанта